常用生物染色剂--考马斯亮蓝
浏览次数：8594发布日期：2012-07-09
考马斯亮蓝有G250和R250两种，在颜色索引（Colour Index）中给出了不同的编号（42655和42660）。亮蓝G和亮蓝R在冷水中分别为微溶和不溶，在热水和乙醇中分别为可溶和微溶。两种染料均能对固定的蛋白进行有效地染色，使用浓度为溶于甲醇:冰醋酸:水（50:10:40）的0.05%溶液。考马斯亮蓝G250与蛋白质的结合反应十分迅速，是常用的蛋白染料，染色后为蓝绿色，常用来作为蛋白质含量的定量测定。考马斯亮蓝R250与蛋白质结合虽然比较缓慢，但是燃料可以穿透凝胶，染胶效果好，染色后为红蓝色，且可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。G250也可染胶，但染色过程慢且染色后背景高，脱色困难。
考马斯亮蓝R250（Coomassie brilliant blue R-250）为三苯基甲烷（triphenylmethane），每个分子含有两个SO3-H基团，本身偏酸性，磺酸基与蛋白质的碱性基团结合形成染料-蛋白质复合物。MW=824，λmax=560-590nm。考马斯亮蓝R-250是通过范德瓦尔键与蛋白质结合，可以被洗脱下去，尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色，染色灵敏度比氨基黑高5倍。它与不同蛋白质结合呈现出基本相同的颜色，并且在比较宽的范围内（15-20g），扫描峰的面积与蛋白量呈线性关系。但蛋白质浓度超出一定范围时，对高浓度蛋白的染色不符合Beer定律，用作定量分析时要注意这点。
考马斯亮蓝G250（Coomassie brilliant blue G-250）为二甲花青亮蓝（xylene cyanine brilliant blue），是一种甲基取代的三苯基甲烷。比考马斯亮蓝R250多二个甲基，MW=854；λmax=590-610nm，游离状态下呈红色。染色灵敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。其优点在于它在三lvyisuan中不溶而以胶体形式存在，能选择性地和蛋白质形成复合物，染色迅速，着色深的蛋白质区带在数秒内即可显现出来，约45分钟后着色zui深，成本低，重复性好。当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有zui大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1,000μg/mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程
该方法用于大多数蛋白质的定量是比较的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污剂的浓度超过0．2％影响测定结果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。
1．Bradford浓染液的配制：将100rug考马斯亮蓝G-250溶于50m1 95％乙醇，加入100ml浓磷酸，然后，用蒸馏水补充至200ml，此染液放413至少6个月保持稳定。
2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20ug—150ug／100ul之间绘制标准曲线。
3．将待测样本溶于100~1缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同（用PBS）。
4．按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。
5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30rain。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不得超过30min．
6．根据标准曲线计算待测样本的浓度。
考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。
考马斯亮蓝R-250是电泳的
考马斯亮蓝G250和R250都可以染蛋白，一般用R250，G250染色后背景较深不易脱色。 一般R250 染蛋白，G250 一般测蛋白浓度，也可染胶，敏感性更高但较慢脱色较难。
考马斯亮蓝G250常用的蛋白染料，作定性试验用,染色后为蓝绿色;R250较敏感,做定量实验用,染胶效果较好.染色后为红蓝色 。
